重编程过程

㈠ 北大邓宏魁团队的iPS细胞真的“无致癌性”吗

山中伸弥的iPS细胞重编程技术，能够成功将终端分化的皮肤成纤维细胞重编程成为具有分化多能性的干细胞。但是，山中伸弥的“鸡尾酒法”中采用的转录因子C-Myc以及使用的逆转录酶病毒有诱发癌症的风险。

在iPSC的重编程过程中，重编程转录因子和载体的选用，细胞培养环境的优化是影响iPSC重编程的高效性和标准化的重要因素。
诺莱医学的iPS细胞重编程技术则是利用6个重编程因子并将致癌基因C-Myc替换成非致癌基因和调控基因；另外调节这些因子的表达量，确保每一个细胞周期，这些因子以一定表达分子数量进入细胞。从而达到精确调控因子瞬时表达的目的，准确利用癌化和重编程之间的调控的窗口期，使细胞顺利完成重编程而不是转向癌细胞生成。
在重编程载体选择方面，诺莱医学采用更安全的episomal载体导入重编程因子，并在符合GMP的标准上严格执行。episomal载体具有很快的半衰期，能在最终得到的诱导的体细胞中均不含有外源的episomal质粒（每次细胞分裂就会有5%的EPISOMER丢失，所以在最后得到的细胞里已经没有质粒了）。

㈡ 细胞核重编程的背景理论知识

在受精卵发育成一个成熟个体的过程中，特定类型的细胞一般都是沿“单行道”形成。随着发育的不断进行，这些细胞就会逐渐失去可塑性，成为不可逆的某一特定类型细胞。例如，一个皮肤细胞不会自动地转变成为一个脑细胞，而小肠细胞也不会转变成心脏细胞。然而，却有一些实验方法可以使不同类型细胞之间的转换成为可能。这些方法都是利用细胞核重编程的原理，也就是说让一种类型细胞的核基因表达转变成为胚胎细胞或者其它类型细胞的状况。这一机制引起了科学界的广泛兴趣。
衰老的“生物分子自然交联学说”指出 ：生物生长、发育、衰老的根本原因是细胞的增殖和分化，是各种生物大分子中化学活泼基团相互作用导致的进行性分子交联。该学说在论证生物体衰老的分子机制时指出：生物体是一个不稳定的化学体系，属于耗散结构。体系中各种生物分子具有大量的活泼基团，它们必然相互作用发生化学反应使生物分子缓慢交联以趋向化学活性的稳定。而随着时间的推移，交联程度不断增加，生物分子的活泼基团不断消耗减少，原有的分子结构逐渐改变，这些变化的积累会使生物组织逐渐出现衰老现象。
一个衰老的细胞，其分裂和增殖已经停止，其中的DNA及其他生物分子大部分均处于交联结合状态、生物分子的交联反应向活性分子不断减少的更衰老方向趋衡；但是，如果衰老细胞能够重新步入分裂增殖的轨道或者用其他方式使其生成活性生物分子的速度明显大于交联失活速度，则可以打破这种活性分子不断减少的更衰老趋衡而使细胞回复到比较年轻甚至全能的状态。

㈢ 细胞核重编程的相关的机理

将一个活细胞核成功地移植到已经去核的蛙卵中的实验，首次证明可以通过实验方法来逆转细胞的分化状态。Briggs和King首次成功实现通过移植Rana pipiens的囊胚细胞核产生会游动的蝌蚪。但是，他们发现如果移植的是处于胚胎发育较晚阶段（肠胚）的细胞核，就会出现非正常发育现象。于是，他们提出细胞分化可能涉及不可逆转的细胞核转变。不久之后，有人在南非青蛙Xenopus laevis上进行了相似的实验。按照同样的实验方法，他们发现即使用于移植的核是来自于完全分化的细胞，也能得到发育完全正常并且具有生育能力的雄性和雌性青蛙，在该实验中是供体蛙的小肠上皮细胞。这些实验结果告诉人们，细胞分化是可以被完全逆转的，并且不可逆的细胞核变化是非必须的。这一过程涉及细胞核基因表达的改变，但并不涉及基因本身。因此，即使在发育过程中，细胞之间也能变成彼此不同、具有各自功能且能稳定存在的个体，但是基因组在所有不同细胞类型中都是一样的（产生抗体的免疫细胞除外）。因此，它们具有保持形成其它不同类型细胞的潜力。
这一领域的突破来自于多利羊的实验，这个实验将从成体羊身上分离出来的，并且在体外培养的乳腺细胞的细胞核移植到去除了细胞核的羊卵内，从而产生出正常成体山羊。多利羊以及后来的探索研究表明，可以利用成体哺乳动物的细胞核来完全逆转细胞分化过程，并且暗示，这一个机制可能也适用于人类。通过移植成体猴细胞核得到猴胚胎干细胞的实验就是证明这一假设的重要一步。这些具有完善的生长和分化功能的细胞是从用成体猴的细胞核移植到去核猴卵细胞后发育成的胚泡中分离出来的。因此，在人类的卵子里面也非常可能包含着能逆转成体人类细胞分化进程的因子。 用卵子进行细胞核重编程值得关注的一个地方是卵子具有以100%的效率重编程已经定向分化了的精子细胞核的能力。另外一个优点是利用这一方法并不需要对移植的细胞核及其产生的重编程细胞进行永久的遗传学改变（即病毒插入、强制打开特定基因等）。因此，挖掘出其中的机理就显得格外重要。我们需要解决的问题是为什么重编程能够成功实现？而又是什么因素常常导致这一过程的失败，即便是在使用卵子细胞的情况下？
有人利用卵母细胞（第一次减数分裂早期的雌性生殖细胞，是产生卵子的前体细胞）探索了卵细胞（处于第二次减数分裂中期）的重编程机制。许多移植进卵母细胞生殖泡的哺乳动物体细胞核被直接重编程而表达干细胞标志基因，包括Oct4, Nanog和Sox2（图1B）。在卵母细胞内进行的细胞核重编程不会产生新的细胞，但是与卵子相反的是，这一过程的发生既不需要细胞分裂，也不需要蛋白质的合成。与这个重编程伴随而生的机制包括：异染色体的开放（图3）；分化标记，如DNA甲基化的去除；组蛋白修饰以及组蛋白交换等等。这些机制发生的基础是，受精卵拥有能引起上述效应的高浓度特定蛋白。如果卵子的蛋白能够在几秒或几分钟的时间内被交换到移植进来的体细胞核的话，那么完全重编程就应该总会发生。
但是，这个概念却和另一个事实相悖，那就是卵子常常不能完全重编程植入其中的体细胞核。如果以上所说的染色体蛋白迅速交换适用于卵子里用来重编程受精卵的细胞核的话，在卵细胞第一次分裂之后，蛙类细胞就会需要一定的时间，并且哺乳动物细胞需要更多的时间去完成彻底的重编程。但这通常不会发生。一个可能的原因是移植进来的细胞核携带了供体细胞的表观遗传学记忆。例如，在肌肉细胞里取出的细胞核，用于重编程后，在重编程的胚胎里发育出来的神经或其它非肌肉细胞里还会强烈的表达与肌肉相关的基因。这可能是由卵子组蛋白里大量存在的H3.3亚型整合到核移植后的供体细胞核里所引起的。组蛋白H3.3的表达被认为能阻碍重编程的发生，并且会保留以前基因表达的记忆。 从技术发展的角度来看，是有可能让两个细胞发生融合，同时用细胞分裂抑制剂来保证融合后两个细胞核是分离的（图1C）。在这些融合体里面，主导细胞通常是体积较大并且分裂活性较强的那个，而且还会影响另外一个细胞核的基因表达情况。这方面的例子包括红细胞和体外培养的正在增殖的细胞的融合，以及人类肝脏细胞和肌肉多核细胞的融合。如果去掉细胞核的一种体细胞的细胞质与另外一种细胞融合的话，它们也会将供体细胞的表达谱强加于受体细胞的细胞核之上。但是，由于这些融合细胞生长不佳，因而也没有太大的医学意义。
我们可以从上述这些实验中得到一些重要的结论。其一，细胞核的涨大和染色体的去染色质化会发生在基因表达谱的重编程之前（图3）。其次，新的基因表达谱并不依赖于供体基因表达谱的退去或者细胞分裂。所以上述这些都不是重编程所必需的。再一个重要的结论就是，分化的细胞以及胚胎的细胞包含可以改变其它细胞的细胞核基因表达情况的调节分子。当受体细胞体积非常大的时候，例如卵子或肌肉束（100个或更多的肌肉细胞形成的大型细胞），它自身的调节分子大大超过可以让细胞产生出现胚胎干细胞特征的外来调节因子就变得可以理解了（图4）。这些分子在正常生理情况下的作用可能是确保这些细胞以及它们的后代不会逃离它们所属的种系或者改变细胞类型。换句话说，细胞似乎在不停地重编程自我以保证它们自己以及后代保留在原来的品系里面。 该领域一个惊人突破发生在2006年，Takahashi和Yamanaka发现向小鼠成体成纤维细胞里转入四个基因（Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4）以后，这些细胞能被诱导成为具有胚胎干细胞特征的细胞。后来引入Nanog表达的筛选系统后，得到的干细胞移植到具有免疫耐受能力的受体胚胎时，还显示出参与发育的能力。因此可以证明它们是具有多能性的，所以叫做诱导性多能干细胞，或称iPS细胞。从人的体细胞上获得多能干细胞也需要上述的四个转录因子或者另外一组由Oct4、Sox2、Nanog和Lin28组成的重编程基因。这些程序现在已经得到确认并得到了发展。实验已证实iPS细胞可以从终末分化的胃和胰脏细胞中得到，并且在去除癌基因c-Myc的情况下也能得到。这些干细胞似乎与胚胎干细胞并没有多大的区别，并将有可能最终培养出病人特异性细胞来进行细胞治疗，也可用于提供合适的能分化为各种组织的细胞来源，或者用来测试潜在的治疗药物。但是，这些都需要在采用改良方法去除由病毒载体引起的基因组插入隐患后才有可能成为现实。最近的成果表明，稳定的基因组插入并非必不可少，并且有研究报道称可以使用腺病毒或者质粒来传导外源基因，意味着我们离成功又进了一步。
通过导入外源因子而使分化的体细胞变成iPS细胞的机理目前还不清楚。因为在早期的实验中，这些细胞出现的比例是如此之低（起始细胞的110000~11000），并且被感染的细胞一般需要在外源因子存在的情况下增殖将近两个星期，这些看似是偶然形成的iPS细胞的来源确实难以分析。在某些情况下，多能性状态的维持可能需要抑制分化程序，其可能涉及的机制已经在其它综述里提及。 通过外源表达基因来改变细胞的分化类型在很多年前就由Weintraub发现“主导基因”MyoD后提出了。过表达这个在肌肉细胞里特异表达的转录因子就足以将一系列非肌肉细胞转变成为肌肉细胞了。然而，在其它一些类型的非肌肉细胞里，这种转变只是暂时的，或者根本就无法观察到。在观察到肌肉样的细胞出现之前，在好几个细胞世代里对外源MyoD表达的选择是必需的。一旦转变成为肌肉细胞以后，MyoD就会激活自身的持续表达，外源MyoD的过表达就不再是必需的了。
细胞类型的转换在其它好几种细胞类型之间，特别是形成血液的细胞品系之间，也可以通过外源表达一些转录因子来实现。这些转录因子的相互平衡能激活或抑制决定细胞命运的基因表达。在这些变化当中（图5C），在新类型细胞形成之前，可能涉及一个倒退到分化程度较低的状态，也就是一个去分化过程。就MyoD而言，培养的细胞经过许多细胞分裂的选择才能最终形成新的细胞类型。
在这个领域的一个最新的进展就是将胰腺的外分泌细胞直接转变成内分泌的β细胞（图5D）。在这个研究当中，用腺病毒转入三个通常为胰岛β细胞分化所需的转录因子：Pdx1、Ngn3和MafA后，就能够将20%的成功转染的外分泌细胞转变成能产生胰岛素的β细胞。携带外源基因的腺病毒不必整合到外分泌细胞的基因组当中，并且对外源基因表达的需求也是暂时的。另外，这一品系转变并不需要细胞分裂。这个细胞品系转换和由Yamanaka最早做出的iPS一样，为转变细胞命运提供一条共同的策略，那就是设法找出一系列的转录因子来实现细胞类型之间的转变。 细胞分化的两个基本特征影响着我们对细胞核重编程的理解。一个是每种细胞似乎都表达着一些决定它们分化状态的基因，这一特征在细胞融合实验中尤其明显。因此，肌肉细胞就会通过自激活高水平的例如MyoD这样的基因去维持自身的状态。这样，细胞越大，或者越像胚胎干细胞，它就会拥有更多“自我重编程”分子。因此，卵子在没有添加外源因子的情况下也很容易被重编程。
在所有重编程的实验里，第二个基本特征是当细胞的分化程度变得越高，通过外源基因来重塑表达谱就变得越困难。当细胞开始它们的终末分化道路时，分化的细胞状态变得越来越牢固，并且堵上其它不恰当的分化途径。掌握这个理论成为这一研究领域的一个巨大挑战，并且大量的信息化工作已经在DNA和组蛋白层面上展开了。一个普遍的假说就是“快速逃逸”策略。我们提出在非活性转录基因的调控区，DNA和组蛋白的结合会变得越来越紧密。虽然大多数的蛋白质会以几秒钟或几分钟一次的频率解离与之结合的DNA，并且在一些特殊情况还需要更长的时间，一个由多组分组成的蛋白复合物则可能会在DNA上拥有很长的逗留时间。因此，一个蛋白复合物的所有组分都刚好解离DNA，并且让重编程因子结合上去的几率非常小。在胚胎干细胞里，大多数基因（在分化的细胞里这些基因是具有活性的基因）就会处于一种去浓缩的状态，使大蛋白复合物具有较短的逗留时间。
根据这个假说，无论是通过核移植、细胞融合、iPS，还是转分化来实现的重编程的发生几率都依赖于统计学上DNA调控区域的可进入程度、作用时间、转录本的浓度和其它调控因子。体积大并且拥有大量调节因子的细胞，如卵子和肌肉管，就会像其它通过实验增强转录因子浓度的细胞一样容易被重编程。未来，一个重要的突破就是要掌握为何分化后细胞的细胞核比胚胎细胞的细胞核更难以重编程。这可能涉及到了组蛋白去浓缩化的解释。

㈣ 多能干细胞与细胞重编程的定义

多能干细胞
1、能自我更新并具有分化成各种细胞潜能的细胞。多能干细胞最初分化为定向干细胞。包括淋巴样祖细胞和髓样祖细胞。
2、具有分化成多种分化细胞潜能的干细胞系细胞。如胚胎干细胞和成体干细胞。
细胞重编程
细胞重编程(Reprogramming
Cells)指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能性状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体的过程。

㈤ 什么是细胞重编程，什么是细胞转分化它们的过程是怎样的求详解！拜托了！！

2006年日本科学家山中伸弥(Shinya
Yamanaka)首次利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到了类似胚胎干细胞的一种细胞类型——诱导多能干细胞(iPSCs)。这一了不起的成果在本月早些时候被授予了诺贝尔生理学/医学奖。
尽管近年来iPS技术不断取得发展，各种改良技术时有出现。然而转化效率低下一直都是科学家们头疼的问题。成为了iPS临床转化的重要障碍之一。此外，由于基因插入可能导致细胞癌变，研究人员和临床医生对于推动这些细胞的潜在治疗应用也一直抱谨慎的态度。
现在，斯坦福大学医学院的研究人员设计了一种高效安全的新方法，只需利用基因编码的蛋白就可以生成诱导多能干细胞。这一研究成果发布在10月26日的《细胞》(Cell)杂志上。
这并非是首次尝试这样的方法。许多研究人员曾证实利用蛋白质来生成诱导多能干细胞虽然有可能实现，但效率却远远低于病毒方法。斯坦福大学的研究人员能取得前所未有的成功归因于一个意外的发现：最初方法中使用的病毒不仅仅对于基因传递至关重要。
斯坦福大学心血管研究所副所长和医学教授John Cooke博士说：“过去一直认为病毒仅仅是作为特洛伊木马(Trojan
horse)将基因传递到细胞中。现在我们知道病毒可导致细胞松开染色体，使得DNA发生逆转至多能状态必需的改变。”
无需人类胚胎，iPS细胞为解决与干细胞研究相关的伦理道德困境提供了一个可能的替代方法。它们由机体内承担某一专门功能的成体细胞生成。在山中伸弥之前，人们认为这些细胞绝不可能恢复为起源的多能干细胞。然而山中伸弥却证实这些高度特化的细胞比之前认为的具有更大的发育灵活性或可塑性。在存在四个基因的条件下，它们就可以呈现出胚胎干细胞的特征，在合适的条件下可以变成几乎所有的细胞类型。
现在Cooke研究小组确定了这一转变发生的一个重要的组件。Cooke说：“我们发现当细胞暴露于一种病原体时，它会发生改变以适应或抵御挑战。这一先天免疫的一部分包括促进了DNA的可接近性。这使得细胞能够伸入它的遗传工具箱中，取出生存所需的东西。”它也使得多能诱导蛋白能够修饰DNA，将皮肤细胞或其他的特化细胞转变为一种胚胎干细胞样的细胞。
由于细胞激活了一种与存在病毒遗传物质时的炎症相似的免疫反应，研究人员将这一过程称为“转炎症”(
transflammation)。他们认为他们的研究发现有可能为在人类中使用iPS细胞，以及阐明多能性发生借助的生物学信号通路铺平了道路。
Cooke和同事们一开始就致力于优化利用细胞渗透性蛋白来重编程成体特化细胞变为多能干细胞。他们知道蛋白质进入到了细胞的细胞核中，在实验室它们能够结合正确的DNA序列。它们还能够维持过去采用其他方法重编程细胞的多能性。那么为何这些蛋白远不如病毒方法有效呢?
当研究人员将暴露于细胞渗透性蛋白的细胞的基因表达模式与负载基因的病毒感染的细胞进行比较时获得了突破：它们完全不同。Cooke想知道是否有可能病毒的某些特性对此负责。
研究人员利用细胞渗透性蛋白质和一种无关病毒重复了这一试验。多能性转化的效率显著提高。进一步的调查揭示这一效应是由于细胞内Toll样受体3(Toll-like
receptor 3)信号激活所致，利用小分子模拟这一病毒遗传物质触发信号通路具有相似的效应。
“这些蛋白质是非整合性的，因此我们不必担心病毒诱导对宿主基因组的损害，”Cooke说。此外他还指出利用细胞渗透性蛋白可以赋予对重编程过程更高水平的控制，有可能促成在人类治疗中使用iPS细胞。
“现在我们知道当受到病原体挑战时细胞会呈现出更大的可塑性，理论上我们可以利用这一信息进一步操纵细胞诱导直接重编程，”Cooke说。
直接重编程涉及将像皮肤细胞这样的一种特化细胞诱导成为如内皮细胞这样的一种细胞分化类型，无需通过中间的多能状态。斯坦福大学的研究人员Marius
Wernig博士利用直接重编程成功地将人类皮肤细胞转变为了功能性的神经元。